手 工 提 取 流 程

1.   样品的处理：

●   新鲜样品：

液氮研磨：新鲜样品可以用液氮研磨成粉末。研磨完成后，取小于100mg新鲜样品或者小于20mg干燥样品，加入600μl Buffer FPL与4μl RNase A涡旋混匀。（Buffer FPL与RNase A可以根据样品量预先混匀）。

珠磨仪：在2ml的离心管中加入1颗4mm的不锈钢珠（需单独购买）、600μl BufferFPL与4μl RNase A。加入小于100mg新鲜样品或者小于20mg干燥样品，叶片等易磨样品按65Hz，90s研磨一次。豆粒等难磨样品按65Hz，120s研磨2次。豆粒等要预先捣碎，直径不超3mm研磨效果更佳。

●   干燥样品：用研钵或研磨研杵研磨成粉末。小于20mg干燥样品，加入600μl Buffer FPL与4μl RNase A涡旋混匀。

2.    65℃水浴10分钟。孵育过程中短暂涡旋管子几次。

     注意：珠磨仪研磨的样品，可以不用水浴直接进下下一步操作。

3.       14,000×g下离心5-10min。

4.       转移300µl上清到新的离心管中加入600 µl Buffer MB（第一次使用前加入异丙醇）和20µl MagIso Beads，混匀。静置2-4分钟。

5.       将离心管放置于磁力架上静置1-2min，待磁珠完全吸附时小心去除液体。

6.       加入600μl Buffer MW1（第一次使用前加入无水乙醇），盖上离心管涡旋15s，放回磁力架，离心管与磁力架一起颠倒3-4次，磁吸1min，吸弃所有液体（包括管盖中残留的）。

7.       加入600μl Wash Buffer（第一次使用前加入无水乙醇），盖上离心管涡旋15s，放回磁力架，离心管与磁力架一起颠倒3-4次，磁吸1min，吸弃所有液体（包括管盖中残留的）。

8.       重复上一步操作步一次。

9.       空气干燥2-5分钟。 干燥不能太长时间，否则会影响洗脱。

10.     加50~100µl 预热至55^oC的Buffer TE或灭菌水等缓冲液，涡旋打散磁珠。静置3~5分钟，其间轻轻振荡1~2次加速DNA溶解。

11.    转移至磁力架上，静置1-2分钟。转移DNA溶液至新的1.5ml离心管中。